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Dazu kam der große Brand vom 16. März 1510, der fast die ganze Stadt in Asche legte. Kaum war sie wieder erstanden, brach die verheerende Hildesheimer Stiftsfehde aus (1519-1529), in der wohl kaum eine andere Stadt so furchtbar gelitten hat wie die unsere. Nachdem es zwischen Bischof Johann IV. und der Ritterschaft zum offenen Streit gekommen war, brachen die ersten Feindseligkeiten am Palmsonntag des Jahres 1519 aus.
Die Braunschweiger und die Calenberger, Verbündete der Ritterpartei, erschienen am 4. Juni 1519 mit starken Streitkräften vor Peine. Zweimal berannten sie die Wälle der Stadt, beide Male schlugen die tapferen Peiner sie wieder zurück.
Zwei Verräter zeigten dann dem Feind geheime Wege durch das Moor zu einer Stelle, die von den Verteidigern nur schwach besetzt war. Die Belagerer drangen in die Stadt ein. Die Peiner Kämpfer mussten sich in die Burg zurückziehen. Die Stadt ging in Flammen auf.
Häufig wechselte das Kriegsglück in dieser Fehde, die immer wieder aufflammte. Im September 1521 standen die Feinde wiederum vor den Mauern Peines. Schließlich zogen die Feinde wieder ab, nachdem sie die ganze Umgebung verwüstet hatten.
Am 13. Juli 1522 stand der Feind zum dritten Male vor der Festung Peine. Auch diesmal konnte die Burg nicht eingenommen werden. In dieser Zeit soll die Sage von der "Peiner Eule" entstanden sein. Der überlieferte Spruch besagt, dass „Peine was maket so feste, dat de Ule blev sitten in´n Neste.“. Die Sage wird in verschiedenen Fassungen erzählt. Seither ist jedenfalls die Eule das Symbol für Wachsamkeit und Standhaftigkeit und die Rettung Peines aus schwerer Kriegsnot.
Mit der Eule verbunden war Peine schon vor Stiftsfehde-Zeiten. Allerdings in einem eher negativen Zusammenhang, wie in einer Sage erzählt wird: In einer Scheune hatte sich eine Eule niedergelassen. Der Vogel versetzte die Peiner dermaßen in Angst und Schrecken, daß sie das Gebäude samt dem darin sitzenden „Untier“ niederbrennen.
Die Bezeichnung „Ulennest“ für Peine wandelte sich nach der Stiftsfehde grundlegend vom Spottnamen zum Wahrzeichen der Stadt.